PCR, mi ez
Polimeráz láncreakció (PCR. A PCR) találták 1983-ban, Keri Myullis (amerikai tudós). Ezt követően ő Nobel-díjat kapott találmány. Jelenleg, PCR diagnosztika egyik legpontosabb és érzékeny módszerek diagnosztizálására fertőző betegségek.
Polimeráz láncreakció (PCR) - kísérleti módszer a molekuláris biológia, az eljárás jelentősen növeli a koncentrációt az egyes kis nukleinsavfragmensek (DNS) a biológiai anyagot (minta).
Emellett egyszerűen számának növelése DNS másolat (ezt a folyamatot nevezik amplifikáció), PCR lehetővé teszi sok más manipuláció a genetikai anyag (a mutációk bevitelével, splice DNS fragmentumok), és széles körben használják a biológiai és orvosi gyakorlatban például, a diagnózis (genetikai, fertőző) apasági, gén-klónozás céljára, mutációkat izolálása új gének.
Sajátosságai és alkalmazása
PCR - módszer a molekuláris diagnosztika egy sor fertőzés vált a „arany standard” idő próbáját, és gondosan tesztelt klinikailag. PCR-eljárással, hogy meghatározzuk a jelenléte a kórokozó, még akkor is, ha a mintában csak néhány DNS-molekulák a kórokozó.
PCR segítségével diagnosztizálják a jelenléte hosszú növekedési kórokozók, anélkül, hogy időigényes mikrobiológiai módszerekkel, ami különösen fontos a nőgyógyászati és urológiai diagnosztizálására urogenitális fertőzések, nemi úton terjedő fertőzések (nemi betegségek).
Továbbá, ez a módszer végzik diagnózis a vírusos fertőzések. mint például a hepatitis. HIV és mások. A a módszer érzékenysége jelentősen felülmúlja a immunohomicheskih és mikrobiológiai módszerek, és a módszer elvét diagnosztizálására jelenlétében fertőzés jelentős antigenikus variációt.
A sajátossága a PCR PCR technológia akár az összes vírus, Chlamydia, Mycoplasma, Ureaplasma, és a legtöbb más bakteriális fertőzések eléri a 100%. PCR eljárással kimutatható, még egyes sejtek a baktériumok vagy vírusok. PCR diagnosztika jelenlétének kimutatására a fertőző ágensek olyan esetekben, amikor más módszerek (immunológiai, bakteriológiai, mikroszkópos) erre nem képes.
PCR eljárás különösen hatásos a diagnózist megnehezíti tenyésztjük, műveletlen és rejtett formák meglévő mikroorganizmusok, amelyek általában találkozott a látens és krónikus fertőzések, mivel ez a módszer elkerüli a nehézségeket tenyésztésével kapcsolatos E mikroorganizmusok in vitro.
A PCR alkalmazását diagnosztika is nagyon hatékony a kórokozókkal szemben, magas antigén variabilitás és intracelluláris paraziták. PCR kimutatása nemcsak az lehetséges kórokozók klinikai anyagból kapott a beteg, hanem az anyagokból származó tárgyak a környezet (víz, talaj, stb. D.). Az urológiai és nőgyógyászati gyakorlatban - kimutatására chlamydia, ureaplasmosis. gonorrhea, herpesz, gardnerelloza, Mycoplasma fertőzés, a HPV - humán papillomavírus; a tüdőgyógyászat - a differenciál diagnosztikájában vírusos és bakteriális tüdőgyulladás, tuberkulózis; gasztroenterológiai - azonosítani helikobakterioza; fertőző betegségek a klinikán - mint egy gyors eljárás a diagnózis szalmonellózis, diftéria, a hepatitis B, a C és G; hematológiai - kimutatására CMV fertőzés, onkovírus.
Specificitás PCR alapul közötti komplexek képződését komplementer templát és a láncindító - rövid szintetikus oligonukleotidok hosszának 18 - 30 betű. Minden összehasonlítható primerek (komplementer) egy szálat kétszálú templát, szegélyező elején és végén az amplifikált rész.
Miután vegyületet (hibridizáció) a templát primer (hőkezelés), ez utóbbi szolgál primerként a DNS-polimeráz szintézise során a komplementer szál templát.
A PCR előírja, hogy a következő komponenseket a legegyszerűbb esetben:
- A DNS-templát DNS-t tartalmazó régiót, amely szükséges, hogy amplifikáljuk;
- Két komplementer láncindítók kívánt végeinek a fragmens;
- termostabil DNS polimeráz;
- dezoxinukleotid-trifoszfátok (A, G, C, T);
- ionok Mg2 +, szükséges polimeráz;
- pufferoldat.
PCR-t végeztünk egy thermocycler - biztosító eszközök szakaszos hűtés és fűtés csövek, jellemzően pontossággal nem kevesebb, mint 0,1 ° C-on A párolgás megelőzése érdekében a reakcióelegyhez a csőbe egy magas forráspontú olaj, például folyékony paraffin. Hozzáadása spetsifichekih enzimek hozamának növelésére egy PCR reakcióban.
Normális esetben, ha PCR-t végeztünk 20-35 ciklus, amelyek mindegyike három szakaszban. Dupla szálú DNS-templát-ra melegítjük, 94-96 ° C-on (vagy akár 98 ° C-on, különösen akkor, ha a termostabil polimeráz): 0,5 - 2 perc a DNS-szál diszpergált. Ez a szakasz az úgynevezett denaturációs - megtörjük a hidrogénkötések között a két áramkör. Néha, mielőtt az első ciklus végezzük előmelegítése a reakcióelegyet 2 - 5 perc teljes denaturálása templát és primerek.
Amikor a lánc tört, a hőmérsékletet csökkentjük, primerek kapcsolatba lépni az egyszálú templát. Ez a szakasz az úgynevezett hőkezelési. A lágyítási hőmérséklet függ a primerek és általában kiválasztott 4 - 5 ° C-on, olvadási hőmérsékletük alatt. Lépés idő - 0.5 - 2 perc.
DNS polimeráz replikálódik mátrix áramkör láncindítóval primerként. Ez - a nyúlás szakaszában. nyúlás hőmérséklet függ a polimeráz. Gyakran használt legaktívabb polimeráz 72 ° C-on nyúlás idő függ mind a DNS-polimeráz típusa, és a hossza az amplifikált fragmens. Általában a nyúlás idő legyen egyenlő egy perc minden ezer bázispárból áll. Befejezése után minden ciklusban gyakran végezzük egy további lépésben a végső nyúlás hogy befejezze az összes, az egyszálú fragmensek. Ez a lépés tart 10 - 15 min.
Anyag előkészítése kutatási és a közlekedési laboratóriumba
A siker az elemzés fontos, hogy megfelelően gyűjteni az anyagot a beteg végzi képzés megfelelően. Ismeretes, hogy a legtöbb laboratóriumi diagnosztikai hibák (akár 70%) végzünk a minta előkészítése lépés. A vérminták laboratóriumi in vitro most vákuum-rendszert használnak, amely egyrészt minimális kárt a betegnek, hanem a másik - lehet, hogy a befogó anyag oly módon, hogy az nem érintkezik a személyzet bármely, sem a környezetre. Ezzel elkerülhető szennyeződés (szennyeződés) anyag, és biztosítja objektivitását PCR-analízis.
DNS - dezoxiribonukleinsav - biológiai polimer, az egyik a két típusú nukleinsavak, amely tárolása, továbbítása generációról generációra és megvalósítása genetikai programja kialakítását és működését az élő szervezetek. A legfontosabb szerepe a DNS a sejtekben - a hosszú távú tárolása információt a szerkezet a RNS és fehérjék.
RNS - ribonukleinsav - biológiai polimer, szoros kémiai szerkezete a DNS-t. Az RNS-molekula az ugyanabból monomer egységeket - nukleotidot, mint a DNS-t. A természetben, az RNS, általában létezik egy láncot. Néhány vírus RNS hordozója a genetikai információt. A sejtben fontos szerepet játszik az információ átvitelére DNS fehérje. RNS-t szintetizáltunk a DNS-templáton. Ezt a folyamatot nevezik átírás. A DNS tartalmaz-nak, ahol az információ szintéziséért felelős három típusú RNS különböző funkció szerint: információ vagy messenger RNS (mRNS), riboszóma (rRNS) és a közlekedési (tRNS). Mindhárom fajta RNS valamilyen módon részt vesz a fehérje szintézisben. Azonban, információt a fehérje szintézisét már csak a mRNS-t.
Nukleotidok - alap ismétlődő egység molekulák a nukleinsavak, kémiai vegyületek, nitrogéntartalmú bázis terméket, egy öt szénatomos cukor (pentóz), és egy vagy több foszfátcsoportot. Bemutatott nukleotidok nukleinsavak, tartalmazhatnak egy foszfát-csoport. Ezek az úgynevezett a bennük nitrogéntartalmú bázisokkal - adenin (A), amely adenin, guanin (G) - guanin, citozin (C) - citozin, timin (T) - timin, uracil (U) - uracil. A készítmény magában foglalja a 4 típusú DNS nukleotid - A, T, G, C, az RNS típusú jól 4 - A, U, G, C Cukor álló összes DNS dezoxiribóz nukleotidból, RNS - ribóz. A formáció a nukleinsavak, nukleotidok, kötődve, kialakítva egy cukor-foszfát gerincét a molekula, egyik oldalán, amelyek egy bázis.
Primer - kotrotkaya alkalmazott DNS replikációjához szükséges a templát szál. Mind a primerek komplementer egy szálának kétszálú templát, szegélyező elején és végén az amplifikált rész.